Клітини-мішені епітеліального походження HeLa в
концентрації 2,5х105 кл/мл вносили у лунки планшета
на 96 лунок (Greiner, Німеччина), в об’ємі по 100 мкл
суспензії в середовищі RPMI-1640 (Sigma) згідно з мето-
дом і культивували протягом 24 год. у стандартних умо-
вах проведення досліджень (5 % СО
2
, 100 % вологість,
температура 37
°
С). Гіпоксію різної тривалості виклика-
ли внесенням у середовище інкубації клітин розчину
хлориду кобальту в кінцевій концентрації 250 мкмоль/л
і культивували протягом 12 та 24 год. [4].
На початку проведення аналізу інкубаційне середо-
вище відбирали, а клітини промивали фосфатно-соль-
овим буфером PBS (англ. Phosphate buffered saline,
рН = 7,4) та проводили інкубування (аплікацію) клітин
з досліджуваними препаратами протягом 5 та 10 хв.
Після цього клітини промивали буфером PBS, додавали
по 100 мкл розчину МТТ (М5655, Sigma-Aldrich, США)
у концентрації 1 мг/мл у натрій-фосфатному буфері
PBS і культивували протягом 4 год. при 37
°
С. Для вибо-
ру оптимальної концентрації розчину хлориду кобальту,
яка викликає гіпоксію епітеліальних клітин, досліджу-
вали його вплив на клітини, зробивши серію розведень,
вносили його безпосередньо в нове культуральне сере-
довище та інкубували в ньому клітини протягом 12 год.,
при цьому аплікацію не проводили. По закінченню інку-
бації розчин МТТ відбирали, після чого додавали по
100 мкл розчину ДМСО та інкубували 5 хвилин при
інтенсивному струшуванні. Оптичне поглинання розчи-
ну вимірювали при довжині хвиль 550 нм (дослід) і
630 нм (референт) на спектрофотометрі «BioTech
uQuant» (BioTek Instruments, Inc США). Усі проби були
проведені трьохкратно й відповідно проаналізовані.
Статистичну обробку отриманих даних проводили за
допомогою програми Microsoft Exscel 2010. Результати
представлені у вигляді M±m, де М – середнє значення, а
m – відхилення від вибіркової середньої. Різницю між
груповими середніми вважали статистично вірогідною
при р < 0,05.
Результати дослідження
та їх обговорення
Для визначення ефективності розробленої фармако-
логічної композиції, а саме її антигіпоксичних властиво-
стей, необхідно було індукувати гіпоксію у клітинах епі-
теліального походження HeLa в експерименті. Згідно з
даними літературних джерел, для експериментального
моделювання умов, наближених до гіпоксичного стану,
використовують розчин хлориду кобальту, оскільки вва-
жають його одним з ефективних агентів, за допомогою
якого можна викликати гіпоксію при дослідженні клітин
[8, 9, 12].
Для встановлення оптимальної концентрації розчи-
ну хлориду кобальту, який викликає стан гіпоксії, але не
призводить до значної загибелі клітин, було досліджено
його вплив у межах концентрацій у 50–450 мкмоль/л на
життєздатність клітин HeLa за умов інкубації 12 год. Як
свідчать представлені на рис. 1 дані, розчин хлориду
кобальту при внесенні його в інкубаційне середовище в
межах концентрацій 50–200 мкмоль/л не призводив до
повної загибелі досліджуваних клітин лінії HeLa. Однак,
починаючи з його концентрації 250 мкмоль/л і вище,
спостерігалась часткова загибель клітин, яка прямо про-
порційно посилювалась у міру зростання концентрації
хлориду кобальту, що свідчить про розвиток гіпоксії.
Отже, для визначення антигіпоксичної дії досліджу-
ваної фармакологічної композиції та її складових було
вирішено використовувати розчин хлориду кобальту в
концентрації 250 мкмоль/л, який викликає гіпоксію та
призводить до часткової, але не тотальної загибелі епіте-
ліальних клітин.
У першій частині експериментального дослідження
було розроблено нову фармакологічну композицію міс-
цевої дії для комплексного лікування хворих на генера-
лізований пародонтит, яка має цитопротекторну дію на
епітеліальні клітини, та обґрунтовано вибір оптималь-
них концентрацій, еквівалентних співвідношень і часу
експозиції [1].
Для визначення ефективності розробленої фармако-
логічної композиції, а саме її антигіпоксичних властиво-
стей, було проведено МТТ-тест при інкубації епітеліаль-
них клітин зі створенням умов гіпоксії хлоридом кобаль-
ту протягом 12 год. Дані свідчать, що почала розвиватись
гіпоксія, однак рівень її був незначним. У цих умовах не
було виявлено достовірної різниці у впливі ні окремо
Цитофлавіну, ні Метрогілу із Хлоргексидином, ні фар-
макологічної композиції із трьох препаратів в обидва
строки експозиції аплікації препаратів (5 і 10 хв.). Однак
навіть при цьому рівень життєздатності епітеліальних
клітин при аплікації фармакологічної композиції є кра-
щим у порівнянні з контролем кобальт-індукованої
гіпоксії (рис. 2).
33
ПАРОДОНТОЛОГИЯ
СОВРЕМЕННАЯ СТОМАТОЛОГИЯ 3/2016
0,90
0,80
0,70
0,60
0,50
0,40
0,30
0,20
0,10
0,00
A 550/630 ɧɦ
Ʉɨɧɬɪɨɥɶ 50 100 150 200 250 300 350 400 450
CoCl
2
x 6H
2
O, ɦɤɦɨɥɶ/ɥ
*
*
*
*
*
Рис. 1. Вплив хлориду кобальту у межах концентрацій
50–450 мкмоль/л на життєздатність клітин HeLa
в умовах інкубації 12 год, M±m.
Примітка: * – р < 0,05 відносно контролю.
0,35
0,30
0,25
0,20
0,15
0,10
0,05
0,00
A 550/630 ɧɦ
1
2
3
4
5
CoCl
2
x 6H
2
O, 250 ɦɤɦɨɥɶ/ɥ
5 ɯɜ.
10 ɯɜ.
Рис. 2. Вплив препаратів Метрогіл, Хлоргексидин
і Цитофлавін на життєздатність клітини HeLa
в умовах кобальт-індукованої гіпоксії (12 год.)
при аплікації 5 і 10 хв., M±m.
Умовні позначення:
1 – контроль; 2 – CoCl
2
-індукованa гіпоксія; 3 – Цитофлавін;
4 – Метрогіл + Хлоргексидин + фіз. Розчин як 1:1:8;
5 – фармакологічна композиція.
